Contenu

Axe 5 : Nanobiophotonique

Responsable : Rodolphe Jaffiol

 

Membres actuels :

Rodolphe Jaffiol (MCF), Cyrille Vezy (MCF), RegisDéturche (Ing), Lina Riachy (PhD depuis 2014)

 

Anciens membres :

Céline Boutin (PhD 2005-2008), Pascale Winckler (PhD 2008-2011), Marcelina Cardoso Dos Santos (PhD  2012-2015).

Les activités de l'équipe s’articulent autour de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) appliquée à la biophysique, mais également autour de l’imagerie de fluorescence à haute résolution (i.e. en dessous de la limite de la diffraction). Les problématiques biologiques étudiées sont la fluidité́ de la membrane plasmique de cellules vivantes, l’organisation et la structuration de la membrane, ainsi que l’adhésion et la migration cellulaire. Plus récemment, nous avons initié le développement de systèmes microfluidiques pour l'étude de la motilité́ cellulaire.

 
La Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence (FCS) :

La Spectroscopie de corrélation de fluorescence consiste à illuminer avec un faisceau laser un échantillon de molécules fluorescentes localisées par exemple dans la membrane plasmique d'une cellule. Dans cette approche "conventionnelle" de la FCS, les fluctuations du signal de fluorescence sont enregistrées tandis que les fluorophores diffusent à travers le volume d'observation, ce dernier résultant d'une détection confocale et d'une importante focalisation du laser d'illumination (voir dispositif ci-dessous). De manière intéressante, l'amplitude des fluctuations ne devient significative que lorsque la concentration des molécules est suffisamment faible, typiquement nanomolaire (nM). Cette sévère condition de dilution est en réalité très avantageuse, tout particulièrement dans le cadre d'études biophysiques, puisqu'elle ne va pas induire de forte modification du système étudié, présentant alors la FCS comme une technique non perturbative au regard d'études in vivo.

Le signal de fluorescence est typiquement enregistré à l'aide d'une photodiode à avalanche (détecteur rapide et sensible). La dynamique temporelle des processus physicochimiques à l'origine des fluctuations de fluorescence sont accessibles en calculant l'autocorrélation temporelle du signal de fluorescence, notée G. Un exemple typique de fonction d'autocorrélation G est donné sur la figure ci dessus. Au temps court (1 à 10 nanosecondes) son évolution est gouvernée par le processus de dégroupement de photons. Entre 10 et 100 nanosecondes, c'est la dynamique rotationnelle de la molécule qui apparaît. Entre 0.1 et 1 microseconde, c'est la cinétique des transitions vers l'état triplet de la molécule qui prédomine. Au temps long (supérieur à 10 microsecondes), l'évolution de la fonction d'autocorrélation est majoritairement gouvernée par les processus de diffusion. En d'autres termes, le temps de déclin de G correspond au temps moyen nécessaire aux molécules fluorescentes pour traverser le volume d'observation. On parle alors de temps de diffusion. La mesure des temps de diffusion constitue à l'heure actuelle l'un des enjeux majeurs de l'application de la FCS en biologie. Dans le cas de molécules qui diffusent dans les membranes plasmiques, ce temps de diffusion est fortement influencé par l'organisation locale et les hétérogénéités de la membrane. Ainsi, réciproquement, la FCS peut être utilisé efficacement pour retrouver et étudier l'organisation sub-micrométrique des membranes cellulaires.

 

Fluidité et organisation membranaire des cellules vivantes :

Dans le domaine de la recherche contre le cancer, la résistance à la chimiothérapie est en partie liée à des processus biochimiques membranaires. Les interactions entre le médicament et la membrane plasmique mettent en jeu des mécanismes complexes et encore très mal compris. Ces derniers peuvent être associés à une modification de la fluidité ou de la perméabilité de la membrane, mais aussi à l'apparition de micro-domaines (rafts, caveolae) ou encore des protéines d'expression du rejet. Tous ces mécanismes membranaires peuvent êtres observés en FCS à l'aide de la diffusion latérale de molécules fluorescentes. En conséquence, nous utilisons la FCS afin d'explorer la fluidité membranaire de cellules résistantes au traitement anti-cancéreux, en comparaison avec des cellules sensibles au traitement (c'est-à-dire sensibles à l'action d'un médicament comme la doxorubicine). Nous étudions également la diffusion d'une protéine membranaire surexprimée dans les cellules résistantes, la P-glycoprotéine.

Pour chaque lignée cellulaire (lignée résistante, sensible...) il est possible d'analyser statistiquement les temps de diffusion enregistrés sur des cellules individuelles. Un exemple de distributions des temps de diffusion est donné ci-dessous. Différentes informations peuvent êtres extraites de ces distributions. La valeur moyenne nous renseigne sur la fluidité globale de la membrane plasmique. La variance (ou l'écart-type) donne des informations importantes sur l'hétérogénéité du système étudié. Le profil de la distribution donne également des informations pertinentes. Pour cela, nous avons développé un code Monte Carlo pour simuler la diffusion de molécules fluorescentes dans la membrane plasmique en présence de différents domaines plus ou moins visqueux et perméables. Nous avons ainsi montré qu'il existe un lien entre la fluidité et l'organisation de la membrane en terme de domaine. Cette approche, lorsqu'elle est conduite sur un grand nombre de cellules, peut nous permettre d'obtenir des informations très précises sur la micro-viscosité des  membranes, et donc sur son organisation locale.

 
Spectroscopie et microscopie de fluorescence par excitation non radiative :

Nous avons développé une nouvelle technique d'excitation de molécules fluorescentes qui permet de s'affranchir de la limite de diffraction en microscopie (i.e. atteindre une résolution nanométrique en microscopie optique). Cette technique est basée sur une excitation indirecte des molécules fluorescentes via un transfert d’énergie non radiatif de type FRET (Förster Resonance Energy Transfer). La résolution du microscope est alors définit par la portée spatiale de l'efficacité du transfert d'énergie (typiquement de 1 à 10 nanomètres en FRET). Pour cela une lamelle couvre objet est recouverte d'un film mince de boîtes quantiques (Quantum dots) qui vont jouer le rôle de donneur dans le processus de transfert d'énergie. Les accepteurs seront des molécules fluorescentes, soit en solution, soit dans la membrane d’une cellule vivante. Cette technique vise à réduire, jusqu’à des dimensions nanométriques l’extension axiale du volume d’observation en microscopie de fluorescence (voir la figure ci dessous). Le caractère innovant de la microscopie par excitation non radiative est que tout repose sur une simple modification du substrat sur lequel est déposé le système biologique à étudier (des cellules vivantes par exemple). Ainsi nous avons montré qu'il était possible de détecter et d'étudier en FCS la diffusion de molécules individuelles dans des solutions très concentrées (supérieur à la micromole).

Dans le domaine de l'imagerie cellulaire, cette technique nous offre l'opportunité d'observer et d'étudier les points d'adhésion d'une cellule sur son support. La figure ci dessus représente le schéma du dispositif mis en œuvre. Nous proposons un éclairage laser grand champ de manière à étudier un petit groupe de cellules. L’excitation « effective » des fluorophores se fait parles boîtes quantiques via le transfert d'énergie non radiatif. Il faut donc que les fluorophores, présents dans la membrane cellulaire, soient suffisamment proches de la couche de Q-Dots pour que le FRET puisse avoir lieu. La profondeur d’excitation est alors donnée par l’efficacité du FRET (en orange sur la figure) soit typiquement une dizaine de nanomètres au dessus de la surface. Les membranes des cellules ont été marquées avec de la DiD, une molécule fluorescente amphiphile venant préférentiellement se placer dans la membrane plasmique. L’adhésion cellulaire conduit à des modifications morphologiques très importantes de la cellule. Ces modifications sont par exemple un aplatissement marqué de la cellule et l’apparition de protrusions. Dès lors que la membrane plasmique se trouvera à quelques nanomètres de la surface, un signal de fluorescence apparaîtra (les points rouges sur l'image). C'est tout particulièrement vrai au niveau des points focaux d'adhésion à l'extrémité de protrusions membranaires comme des lamellipodes et des filopodes. Ainsi nous observons des spots de fluorescence aux extrémités des filopodes qui entourent la cellule imagée sur la figure, mettant en évidence l'existence très probable de contacts focaux sur ces zones.

 

Collaborations :

En france : Pierre Jeannesson et Hamid Morjani, Unité MEDyC (Matrice Extracellulaire Dynamique Cellulaire), UMR CNRS 6237, Faculté de Pharmacie, Reims, France.

Publications récentes en relation avec ces travaux :

[1]. Spatial fluorescence cross-correlation spectroscopy, R. Jaffiol, Y. Blancquaert, J. Derouard, Applied Optics 45,6 (2006) 1225-1235.

[2]. Measurement of surface concentration of fluorophores by fluorescence fluctuation spectroscopy, A. Delon, J. Derouard, G. Delapierrre, R. Jaffiol, Optics Letters 31, 8 (2006) 1142-1144.

[3]. Porous surface statistical characterization via fluorescence correlation spectroscopy, J. Plain, R. Jaffiol, G. Lerondel, P. Royer, Phys. Stat. Sol. (a) 204, 5 (2007) 1507-1511.

[4]. Surface modified single molecules free-diffusion evidenced by fluorescence correlation spectroscopy, C. Boutin, R. Jaffiol, J. Plain, P. Royer, Journal of Fluorescence 18,6 (2008) 1115-1122.

[5]. Effect of different agents onto multidrug resistant tumor cells revealed by fluorescence correlation spectroscopy, C. Boutin, Y. Roche, C. Millot, R. Deturche, J. Plain, P. Jeannesson, M. Manfait, P. Royer, J-M. Millot, R. Jaffiol, Spectroscopy 22,4 (2008) 261-265.

[6]. High heterogeneity of plasma membrane microfluidity in multidrug-resistant cancer cells, C. Boutin, Y. Roche, C. Millot, R. Deturche, P. Royer, M. Manfait, J. Plain, P. Jeannesson, J-M. Millot, R. Jaffiol, Journal of Biomedical Optics 14,3 (2009) 034030.

[7]. Nonradiative excitation fluorescence: probing volume down to the attoliter, P. Winckler, R. Jaffiol, J. Plain, P. Royer, The Journal of Physical Chemistry Letters 1, 16 (2010) 2451-2454.

[8]. Microfluidity mapping using fluorescence correlation spectroscopy: a new way to investigate plasma membrane micro-organization of living cells, P. Winckler, A. Cailler, R. Deturche, P. Jeannesson, H. Morjani, R. Jaffiol, BBA Biomembranes 1818, 11 (2012) 2477-2485.